PCR, reazione a catena della polimerasi: come funzionano i test molecolari.

A cura della Dott.ssa Brigida Garofalo 

                                                                                                                                                             “Audentes fortuna iuvat”

Introduzione 

Con l’avvento della pandemia del 2020 abbiamo spesso sentito parlare della tecnica molecolare  PCR, acronimo di REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI, tanto da diventare sigla estremamente  inflazionata nel linguaggio comune. La tecnologia della PCR ha rivoluzionato l’attività dei laboratori di ricerca e di diagnostica trovando applicazioni ed impieghi in svariati campi della medicina e della biologia. 

Ma cosa è la PCR? Come funziona? Chi è stato il suo ideatore? 

Kary B. Mullis premio Nobel per la chimica nel 1993

Iniziamo proprio dall’ultimo quesito: la  PCR fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il Premio Nobel per la chimica (1993). Mullis era uno scienziato americano, un biochimico per la precisione,  classe 1944, un uomo figlio dei sui tempi , un uomo  che ha vissuto tra genio e sregolatezza, uno scienziato dalla curiosità profonda, eccentrico e forse l’unico premio Nobel che ipotizza un incontro con gli alieni. ( Ballando nudi nel campo della mente, un volume frizzante che parla di vari temi, dal metodo scientifico appunto, alla parapsicologia, all’Hiv e all’Aids, al caso di O.J. Simpson).

Era la primavera del 1983 e come egli stesso ebbe poi a confessare: «Talvolta le buone idee vengono proprio quando non le si cerca. […] Non riuscii quasi a dormire quella notte, con le bombe «desossiribonucleari» che mi esplodevano nel cervello.». Muore il 7 agosto del 2019 a 74 anni e non possiamo fare a meno di chiederci quale sarebbe stata la sua posizione in relazione al Covid-19.

Cosa è la PCR

Nonostante la tecnica abbia visto dei miglioramenti negli anni , l’intuizione e quindi il principio di base è rimasto lo stesso: ottenere rapidamente milioni di molecole identiche di DNA a partire da quantità estremamente ridotte dell’acido nucleico, in altre parole una reazione di amplificazione in vitro di uno specifico frammento di DNA per mezzo di un enzima : la DNA polimerasi.

Non è scopo di questo articolo illustrare i meccanismi biochimici  della tecnica molecolare, tuttavia la figura che segue, seppur estremamente semplificata , può essere utile a livello concettuale anche per i “ non addetti ai lavori” e serve a noi per rispondere al secondo quesito “come funziona?”.

Il numero di nuove molecole di DNA aumenta al succedersi di ogni ciclo. Infatti, durante il primo ciclo da un singola molecola di DNA si ottengono due molecole, ciascuna costituita da un’elica “vecchia” che ha fatto da stampo alla sintesi dell’elica “nuova”; al secondo ciclo ciascuna delle due molecole si denatura, i quattro filamenti di DNA che si ottengono fanno da stampo per l’attività della DNA polimerasi ed alla fine le molecole di DNA diventano quattro. Il processo di amplificazione procede in questo modo di ciclo in ciclo, per cui ipotizzando 36 cicli …otterremmo 68 miliardi di copie!!!!

A questo punto abbiamo compreso cosa fa la PCR, attagliamo adesso questo concetto al tampone molecolare. Come funziona questo tipo di tampone lo abbiamo descritto in un articolo antecedente  (link): evidenzia il materiale genetico del virus, la sua “firma” unica e inconfondibile. 

Ma il test Molecolare con  PCR, é diagnostico oppure no? Come proposta di  riflessione riportiamo di seguito uno studio , pubblicato su JAMA Network, un viewpoint Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2, che descrive come interpretare i risultati e le variazioni nel tempo di 2 tipi di test diagnostici comunemente usati per la diagnosi di infezione da SARS-CoV-2 :

• la reazione di trascrizione inversa della polimerasi a catena (RT-PCR )
• IgM e IgG con dosaggi di immunoassorbimento a correlazione enzimatica  (ELISA)

• la reazione di trascrizione inversa della polimerasi a catena (RT-PCR )
• IgM e IgG con dosaggi di immunoassorbimento a correlazione enzimatica  (ELISA)

Variazione stimata nel tempo nei test diagnostici per la rilevazione dell'infezione da SARS-CoV-2 in relazione all'insorgenza dei sintomi

Nello studio viene evidenziato che nella maggior parte dei soggetti con infezione sintomatica da COVID-19, l'RNA virale, prelevato mediante tampone rinofaringeo, diventa rilevabile giа dal primo giorno in cui sono presenti i sintomi, con un picco entro la prima settimana dall'esordio dei sintomi. Questa positivitа nei casi lievi inizia a diminuire entro la terza settimana divenendo, successivamente, non rilevabile. Al contrario, in pazienti ospedalizzati gravemente malati, la positivitа della PCR può persistere oltre 3 settimane dopo l'insorgenza della malattia. Tuttavia, un risultato PCR "positivo" riflette solo il rilevamento dell'RNA virale e non indica necessariamente la presenza di virus vitale.

Avendo il test molecolare PCR una specificità pari al 100% resta da stabile se un tampone molecolare Rt-PCR è in grado di darci una conferma di diagnosi da Covid-19 oppure no.